Взгляд на био-плёнки в пивоварении

«Пивной камень» (отложения солей кальция), это известная проблема в пивоварении. Также известно и то как он может испортить вкус пива. Однако не все пивовары осознают, что микроорганизмы могут присутствовать в системе, даже если оборудование выглядит безупречно чистым. Часто обитают в системе в виде плёнкообразных колоний, или био-плёнок.

Что такое био-плёнка? Как узнать, есть ли био-плёнка в системе? И если она есть, то как от неё избавиться? Данная статья посвящена механизмам прикрепления и выживания микроорганизмов в био-плёнке. Обсуждаются способы очистки и дезинфекции химическими веществами и методы профилактики и удаления био-плёнок.

Оборудование пивоварни

Био-плёнка — это группа микроорганизмов, которые прикрепились к поверхности и окружили себя непроницаемой полисахаридной оболочкой. Хотя микробиологам не одно десятилетие известно о существовании био-плёнок, только с момента появления сканирующих электронных микроскопов (SEM) био-плёнки были детально исследованы.

Научный подход к микробной методологии заключается в идентификации и анализе одной клетки — от смешанной культуры до чистой культуры — в свободном живом, в свободно плавающем состоянии. А бактерия, физическая и химическая активность которой, как полагают, не зависит от соседних клеток, называется «планктонной».

Планктонная клетка, однако, обладает способностью и склонностью физически прикрепляться к любой поверхности, от неправильной, мягкой ткани тела до твердых, гладких поверхностей (включая нержавеющую сталь). Для полного прикрепления планктонной клетки требуется около минуты. А для набора негенетических, структурных и биохимических изменений в клетках потомства — от 1 до 2 дней. Прикрепленный микроорганизм называют «сидячим». В зависимости от условий, равновесие био-плёнки достигается в течении от нескольких дней до нескольких недель.

Большинство микробных тестов могут легко определить количество организмов, плавающих в жидкостях. С момента, как только микроорганизмы прикрепляются к поверхности, и образовалась био-плёнка, только сканирующий электронный микроскоп может качественно выявить её присутствие. Био-плёнки можно увидеть только таким образом, потому что процесс прикрепления происходит на молекулярном уровне. Для понимания, что такое био-плёнки, важно знать процессы, которые микроорганизмы используют для прикрепления к поверхностям.

Био-плёнки проходят три стадии формирования :

  1. Адсорбция
  2. Адгезия
  3. Привязанность

 

Адсорбция

Адсорбцию не следует путать с абсорбцией. При абсорбции вещество всасывается в систему или через нее. Адсорбция определяется как процесс, при котором молекулы поглощаются на поверхности твёрдого тела химическим или физическим действием. Напомним некоторые общие понятия о типах связей, используемые в физической химии:

  • Ионные связи: потеря или приобретение электронов при объединении противоположно заряженных частиц.
  • Ковалентные связи: возникают, когда два атома делятся внешними электронами.
  • Связи металлов: эти электроны движутся и действуют как проводники.
  • Ван-дер-ваальсовые силы: возникновение связей между близко расположенными атомами или нейтральными атомами. (Эта связь слаба и хрупка).
  • Водородные связи: атом водорода также создает хрупкое соединение между близкими молекулами [1].

В форме планктона бактерии передвигаются и сталкиваются с поверхностями, веществами и другими организмами. Бактерии несут электрические заряды, а их поверхностные белки имеют специфическое полярное расположение. Это позволяет бактериям выборочно выбирать или удаляться от поверхностей и веществ. Уравнение, которое используется для суммирования этой ионной активности в адсорбционной фазе, VT=VA+VR. VT-потенциальная энергия, VA-сила притяжения, VR-отталкивание. Фаза адсорбции обратима. Просто изменив pH или вязкость среды, можно радикально изменить поведение организмов [1].

 

Адгезия

Второй обратимый этап эволюции био-плёнки это адгезия. На этом этапе микроорганизмы распознают элементы, способствующие присоединению. Бактерии соединяются с хозяином, называемым клеточным рецептором, используя законы Михаэлиса. Результирующая реакция записывается как:

R встречает B = R < — > Реверсибельный B, Адгезия

R означает рецептор, а B — бактерия. В процессе обмена формируется слабый комплекс «RB». Необратимое прилипание возникает, только если бактерии имеют или способны вырастить якорные отростки. Процесс необратимого присоединения описывается как:

R + B > Привязанность

Лектины являются неотъемлемой частью процесса адгезии. Термин лектин происходит от латинского lego, legere, что означает «распознавать, выбирать, сортировать». Лектины — это гликопротеины, которые обычно имеют два узла связывания. Бактерии с пили или фимбриями (ворсинками, нитевидными белковыми структурами) содержат лектины, способные отличать такие вещества, как полисахариды, простые сахара и другие углеводы, и пр., тем самым облегчая адгезию. Лектины делятся на две группы: структурные и растворимые или вязкие [1].

Фимбрии — это чрезвычайно тонкие нити, которые окружают определенные микробы (например, E.coli). На одной клетке E.coli может быть сотни фимбрий. Клеточные стенки микроорганизмов содержат полисахариды, они обеспечивают защиту. Полисахариды также покрывают и фимбрии. Фимбрии имеют тенденцию быть липофильными (склонны к накоплению жиров). Энзимы и протеины также аккумулируются во время этапа адгезии. Эти энзимы и протеины реагируют с полисахаридами для того чтобы сформировать сложные биополимеры. Менее стабильные биополимеры теряют контакт с поверхностью при температуре окружающей среды, а более стабильные удерживаются. В итоге наблюдается рост био-плёнки за счёт внутренних процессов (под поверхностью), а не за счёт прикрепления планктонных микроорганизмов, которые способствуют росту био-плёнки с внешней стороны.

Рост био-плёнки на начальном этапе происходит экспоненциально. Рост ускоряется, если присутствует множество организмов-симбионтов. Рост продолжается до тех пор, пока толщина био-плёнки не затруднит поступление питательных веществ к микроорганизмам, или пока сила потока воды, проходящего по био-плёнке, не начнёт смывать верхний слой быстрее, чем он успевает нарасти. Таким образом, анализ на число бактерий фиксирует лишь объём микроорганизмов, которые смываются потом воды в окружающее пространство, а не указывают на истинный объём био-плёнки.

Только около 5-25 процентов общего объёма типичной био-плёнки составляют микроорганизмы. Оставшаяся часть содержит более 95% воды. Сухой остаток состоит из кислых экзополисахаридов, выделяемых организмами. Рядом с микроорганизмами обнаруживаются липополисахариды – высокомолекулярные углеводы, соединённые с липидом (жиром). Эти липополисахариды более гидрофобны, чем экзополисахариды. Смесь экзополисахарид + вода образует студенистое вещество, в случае если достаточное количество ионов кальция заменяет кислые протоны полимеров.

Поскольку био-плёнка является гидрофобной, она не поддается смыванию водой. Это означает, что даже ополаскивание водой с температурой близкой к кипению не полностью избавит поверхность от био-плёнки. Самый верхний слой био-плёнки отслоится, но сама био-плёнка остается нетронутой. Для удаления био-плёнки необходимо механическое воздействие. Такое как очистка щёткой или скребком. Чтобы разрезать и оторвать микроколонию от поверхности к которой она прикрепилась.

 

Привязанность

В течение определенного периода времени (от нескольких часов до нескольких дней) внутренняя структура био-плёнки становится чётко определенной. Она содержит одну или нескольких микроколоний (чистая и смешанная культура). Происходит образование каналов для отвода наружу жидкости, — отходов жизнедеятельности микробов. В то время как планктонные бактерии функционируют как независимые клетки, био-плёнка приобретает вид сложной, но примитивной ткани или органа. Было отмечено, что перенос питательных веществ и растворенного кислорода по каналам происходит не с помощью диффузии, а конвективным потоком, что дополнительно указывает на скоординированные и совместные действия среди популяции клеток био-плёнки для стабильного сосуществования. Каждая микроколония в структуре био-плёнки устанавливает свою собственную метаболическую активность в соответствии с условиями окружающей среды; например, из одной и той же структуры были выделены и аэробный и анаэробный тип бактерий.

Сами бактерии био-плёнки не попадают в этот сравнительно непроницаемое экзополимерное внешнее покрытие. В зависимости от времени, плотности заселения, или условий окружающей среды, жизнеспособные клетки отделены от структуры в очевидной и отрегулированной форме. Свободные же клетки имеют возможность прикрепиться к близкорасположенным или удалённым поверхностям и образовать дополнительные структуры микроколонии. Если «разряженная» бактерия попадает в жидкую питательную среду, фенотип может вернуться в планктонное состояние. За исключением случайных мутаций, у всех бактерий, от планктонных до сидячих (био-плёнка), отсутствуют генетические изменения.

Однако важно отметить, что бактерии био-плёнки, как и их планктонные аналоги, участвуют в обмене генетическим материалом (т. е. конъюгации), так что дочерние клетки от этого переноса генов будут выражать постоянные фенотипические изменения.

А если выделить из биоплёночных культур органическую молекулу и перенести её в суспензию планктонных бактерий, это вызывает угнетение бактериального генома. Эта молекула самостоятельно, без касания клетки к любой поверхности, изменяет до 40 генов для выработки экзополимера, уменьшения размера клетки, изменения химии клеточной оболочки, и снижения метаболически деятельности.

Все эти факторы, по отдельности или вместе, являются источником следующих проблем в пивоварении, таких как:

  • Трудности с удалением био-плёнок с поверхностей без механической очистки;
  • Трудность выделения отдельных бактерий распространёнными лабораторными методами;
  • Высокая устойчивость к ПАВ и другим очистителям;
  • Повышенная устойчивость к биоцидам и дезинфицирующим средствам [2].

 

Ёмкости в пивоварне

 

Удаление Био-плёнки

Там, где это возможно, на поверхностях и в зонах, где наиболее вероятно развитие био-плёнки, рекомендуется использовать те или иные формы механической очистки. Однако очистки следует выполнять с особой осторожностью, чтобы на поверхностях не образовались царапины и углубления, которые могут способствовать закреплению микроколоний.

Для CIP-моек возможно применение сильных окислителей. Ортофосфорная/ азотная кислота в смеси с совместимым ПАВ, как правило, хорошо помогает удалить пивной камень из бродильных ёмкостей. Хорошо зарекомендовали себя в пивоваренной промышленности безщелочные очистители-окислители и хлорированные каустические растворы [3]. Хорошую эффективность в отношении био-плёнок также показали дезинфицирующие средства на основе перуксусной кислоты (PAA) и диоксида хлора (ТвинОксид).

 

Профилактика

Ключом к защите от образования био-плёнок являются правильная очистка и последующая дезинфекция оборудования после каждого использования, особенно поверхностей, которые контактируют с продуктом в течение длительных периодов времени (т. е. резервуаров для кондиционирования, кег, обслуживающих резервуаров, водопроводных линий и пр.) Во время очистки, тщательно контролируйте pH и концентрацию дезинфицирующих растворов. Раствор кислоты должен иметь pH < 2, а щелочные растворы – pH > 12, чтобы обеспечить гидролизацию защитного покрытия био-плёнки из полисахарида. Здесь также необходимо позаботиться о том чтобы не вызвать эрозию поверхностей труб и ёмкостей.

 

Дезинфекция

Исследование показало, что предписанная по регламенту дезинфекция биоцидом после ополаскивания может иметь весьма слабую эффективность в отношении бактерий био-плёнок. BIRKO предлагает применять более высокую концентрацию (например 1000 ppm, четверную для полов и стоков), причём без ополаскивания питьевой водой. А затем промыть дезинфицирующим средством в предписанной концентрации, чтобы вытеснить более концентрированный биоцид из первой фазы дезинфекции.

 

Тестирование

Для выявления био-плёнок требуется очень дорогостоящее и громоздкое оборудование. Поэтому некоторые исследовательские лаборатории применяют методы экологического моделирования. Тем не менее, за последние семьдесят лет накоплено достаточно данных и фактических данных об этих микроформах, чтобы косвенно свидетельствовать о высокой степени подверженности загрязнению био-плёнками оборудования пивоваренных предприятий.

Часто визуальный осмотр поверхностей производится после ополаскивания водой. Вода будет смачивать чистые поверхности, в то время как потенциальные области образования био-плёнки будут выглядеть как островки. Однако здесь требуется осторожность. При очистке щелочными растворами может возникать иллюзия очищенной поверхности [4].

 

Вывод

Хмель, рН, содержание алкоголя и наличие газов делает пиво негостеприимной средой для большинства микроорганизмов. В настоящее время нет известных патогенов, способных выжить в пиве. Тем не менее, у пива может измениться вкус и возникнуть проблемы с хранением, если не поддерживать должную чистоту оборудования. Одной из причин наличия бактерий в пиве и на оборудовании пивоварни могут быть био-плёнки.

 

Ссылки на литературу:

  1. Jean Brisou, BIOFILMS: Methods for Enzymatic Release of Microorganisms 1995 CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, page 17, 19
  2. «Why Bacteria Survive Your Sanitizers», FOOD QUALITY, (March/April), 2000, pages 56-68
  3. Dana Johnson, «Removing Beerstone», Modern Brewery Age, March, 1998, page
  4. Fred Holzhauer, Dana Johnson, «Noncaustic Cleaning in the Brewery», The New Brewer, March/April, 1996, page

 

Перевод с английского. Авторы: Дана Джонсон (Dana Johnson) и Харли Дэймон Свонсон (Harley Damon Swanson), доктор Философии. Корпорация Birko.

Обувликовано в Дайджест Пивоваров (Brewers Digest), Сентябрь/Октябрь 2000.

 

Об авторах.

Дана Джонсон (Dana Johnson) работает в BIRKO Corporation R&D с 1979 года. Он является автором статей по дезинфекция в пивоварении.

Дэймон Свонсон (Damon Swanson) был главным операционным директором корпорации BIRKO и сейчас в отставке. Он получил степень магистра микробиологии в Школе ветеринарной медицины и биомедицинских наук Университета штата Колорадо.

См также: